Proteínas quinase eucarióticas (ePKs) de Schistosoma: identificação, anotação funcional e seleção de potenciais alvos terapêuticos

Apesar do praziquantel ser uma droga eficiente para o tratamento da esquistossomose, a prevalência da doença não mostrou redução significativa nos últimos anos e, até o momento, não existe uma alternativa eficaz para o tratamento dessa doença. Dessa forma, optamos por utilizar as poderosas ferramentas genômicas para identificar potenciais alvos para o desenvolvimento de um medicamento alternativo. Já que proteínas quinase eucarióticas (ePKs) são consideradas alvos para o desenvolvimento de drogas do ponto de vista médico e químico, e um número crescente de inibidores ePKs foram desenvolvidos e aprovados para o tratamento de diferentes doenças humanas, estas se tornaram o foco de estudo desse trabalho. As ePKs de S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium foram identificadas nos proteomas preditos e classificadas em seus devidos grupos, famílias e subfamílias a partir de abordagens filogenéticas. Utilizando as informações dos ortólogos identificados, foi possível selecionar um grupo de ePKs com função predita essencial nesse parasito. A anotação funcional mostrou ainda que grande parte das ePKs selecionadas são ativadoras/efetoras da via de sinalização MAPK. Dessa forma, proteínas chave da via MAPK (SmRas, SmERK1, SmERK2, SmJNK e SmCaMK2), foram as escolhidas para validação experimental. Após redução significativa no nível de transcrito dos genes selecionados, nenhuma alteração fenotípica visível foi relatada em cultura de esquistossomulos.

Contudo, o efeito da diminuição transcricional dos genes no desenvolvimento dos vermes diante do sistema imune do hospedeiro foi avaliado. Evidenciamos que proteínas MAPK JNK quando silenciada causa efeitos devastadores no tegumento de vermes adultos de S. mansoni que leva a morte dos mesmos. E, ePKs da subfamília ERK1 estão relacionadas com a produção de ovos, já que fêmeas com baixos níveis de transcritos SmERK1 e SmERK2 apresentam ovários pouco desenvolvidos e produção de ovos significativamente baixa. Além disso, foi comprovado que o fator de transcrição c-fos está diferencialmente expresso em parasitos silenciados para as proteínas MAPK SmJNK, SmCaMK2 e SmERK1/2. Dessa forma concluímos que o dado genômico, acoplado a ferramentas computacionais preditoras e abordagem experimental, compõem uma metodologia poderosa para o estudo dessa espécie. As proteínas MAPK, SmERK e SmJNK, são alvos de interesse para o desenvolvimento de drogas para tratamento da esquistossomose já que um inibidor contra essas proteínas provavelmente irá interromper o ciclo de vida de Schistosoma e impedir o progresso da doença

Proteínas quinase eucarióticas (ePKs) de Schistosoma: identificação, anotação funcional e seleção de potenciais alvos terapêuticos / Eukaryotic protein kinase (ePKs) Schistosoma: identification, functional annotation and selection of potential therapeutic targets

Apesar do praziquantel ser uma droga eficiente para o tratamento da esquistossomose, a prevalência da doença não mostrou redução significativa nos últimos anos e, até o momento, não existe uma alternativa eficaz para o tratamento dessa doença. Dessa forma, optamos por utilizar as poderosas ferramentas genômicas para identificar potenciais alvos para o desenvolvimento de um medicamento alternativo. Já que proteínas quinase eucarióticas (ePKs) são consideradas alvos para o desenvolvimento de drogas do ponto de vista médico e químico, e um número crescente de inibidores ePKs foram desenvolvidos e aprovados para o tratamento de diferentes doenças humanas, estas se tornaram o foco de estudo desse trabalho. As ePKs de S. mansoni, S. japonicum e S. haematobium foram identificadas nos proteomas preditos e classificadas em seus devidos grupos, famílias e subfamílias a partir de abordagens filogenéticas. Utilizando as informações dos ortólogos identificados, foi possível selecionar um grupo de ePKs com função predita essencial nesse parasito. A anotação funcional mostrou ainda que grande parte das ePKs selecionadas são ativadoras/efetoras da via de sinalização MAPK. Dessa forma, proteínas chave da via MAPK (SmRas, SmERK1, SmERK2, SmJNK e SmCaMK2), foram as escolhidas para validação experimental. Após redução significativa no nível de transcrito dos genes selecionados, nenhuma alteração fenotípica visível foi relatada em cultura de esquistossomulos.

Contudo, o efeito da diminuição transcricional dos genes no desenvolvimento dos vermes diante do sistema imune do hospedeiro foi avaliado. Evidenciamos que proteínas MAPK JNK quando silenciada causa efeitos devastadores no tegumento de vermes adultos de S. mansoni que leva a morte dos mesmos. E, ePKs da subfamília ERK1 estão relacionadas com a produção de ovos, já que fêmeas com baixos níveis de transcritos SmERK1 e SmERK2 apresentam ovários pouco desenvolvidos e produção de ovos significativamente baixa. Além disso, foi comprovado que o fator de transcrição c-fos está diferencialmente expresso em parasitos silenciados para as proteínas MAPK SmJNK, SmCaMK2 e SmERK1/2. Dessa forma concluímos que o dado genômico, acoplado a ferramentas computacionais preditoras e abordagem experimental, compõem uma metodologia poderosa para o estudo dessa espécie. As proteínas MAPK, SmERK e SmJNK, são alvos de interesse para o desenvolvimento de drogas para tratamento da esquistossomose já que um inibidor contra essas proteínas provavelmente irá interromper o ciclo de vida de Schistosoma e impedir o progresso da doença

Biochemical characterization of a calcium-sensitive protein kinase LeCPK2 from tomato.

LeCPK2 (GenBank GQ205414), a versatile calcium-dependent protein kinase (CDPK or CPK) gene was isolated from tomato in our previous study. In this study, the biochemical properties of LeCPK2 were further investigated. To examine the role of the C-terminal calmodulin-like domain (CLD) of LeCPK2 with respect to Ca2+ activation, the kinase activities of recombinant full-length and truncated LeCPK2 were measured by Kinase-Glo® Luminescent kinase assay (Promega). The results showed that LeCPK2 activity was Ca2+-dependent and the C-terminal CLD of 161 residues was essential for the activation of LeCPK2. The activity of LeCPK2 was sharply stimulated by Ca2+ with K0.5 (concentration of Ca2+ for half-maximal activity) of 48.8 and 45.5 nM with substrate histone IIIs and syntide 2, respectively. The optimal concentration of Mg2+ for LeCPK2 activity was 20 and 10 mM for substrate histone IIIs and syntide 2, respectively. The Km value of LeCPK2 towards histone IIIs and syntide 2 was 44.9 μg/ml and 89.52 μM, respectively. The determination of biochemical properties of LeCPK2 would provide some clues on how its activity was regulated in vivo.

Molecular Cloning of Plasmodium vivax Calcium-Dependent Protein Kinase 4

A family of calcium-dependent protein kinases (CDPKs) is a unique enzyme which plays crucial roles in intracellular calcium signaling in plants, algae, and protozoa. CDPKs of malaria parasites are known to be key regulators for stage-specific cellular responses to calcium, a widespread secondary messenger that controls the progression of the parasite. In our study, we identified a gene encoding Plasmodium vivax CDPK4 (PvCDPK4) and characterized its molecular property and cellular localization. PvCDPK4 was a typical CDPK which had well-conserved N-terminal kinase domain and C-terminal calmodulin-like structure with 4 EF hand motifs for calcium-binding. The recombinant protein of EF hand domain of PvCDPK4 was expressed in E. coli and a 34 kDa product was obtained. Immunofluorescence assay by confocal laser microscopy revealed that the protein was expressed at the mature schizont of P. vivax. The expression of PvCDPK4-EF in schizont suggests that it may participate in the proliferation or egress process in the life cycle of this parasite.

Caracterização de proteínas MAPKs e MKPs no Genoma de Schistosoma mansoni: uma abordagem in silico e experimental

Pouco se sabe a respeito dos mecanismos de transdução de sinal no parasito Schistosoma mansoni. A identificação e caracterização dos mecanismos e das moléculas envolvidas em vias de transdução de sinal são essenciais para se entender a biologia do parasito e interações hospedeiro-parasito. As proteínas MAPK (Mitogen-activated protein kinases) desempenham um importante papel na transdução de sinais extracelulares, controlando vários mecanismos celulares essências. As MKPs são o principal grupo de proteína fosfatases que controlam a magnitude e a duração da ativação das proteínas MAPK. Até o presente momento, nenhuma proteína da família das MAPKs ou proteínas MKPs havia sido detalhadamente caracterizada no parasito S. mansoni. Foi realizada uma análise in silico. abragente da versão 3.1 do genoma de S. mansoni utilizando diferentes abordagens de bioinformática, incluindo buscas por similaridade de seqüências realizadas com o algoritmo blast ou com modelos ocultos de Markov (HMM) especificamente elaborados e construídos para identificação de MAPKs e MKPs. Complementarmente foi realizada a anotação manual dos genes que apresentaram hits positivos para proteínas MAPK e MKP utilizando o programa Artemis para integrar as anotações.

Com base nesses resultados quatro proteínas foram selecionadas para posterior validação experimental: uma proteína ERK (SmMAPK1), uma proteína JNK (SmMAPK2) e duas proteínas fosfatase de dupla especificidade (SmMKP1e SmMKP2). Análises in silico revelaram ainda que os aminoácidos importantes para a funcionalidade das proteínas estão conservados. Nas MAPKs os resíduos dos domínios CD e ED, essenciais para o reconhecimento dos ativadores, substratos e desativadores, estão conservados. Nas fosfatases, o sítio de ligação as MAPKs está presente e apresenta os aminoácidos essenciais para a interação entre as proteínas. O cDNA de SmMAPK1, SmMAPK2, SmMKP1 e SmMKP2 está presente em todas as fases de desenvolvimento do parasito. E, em SmMKP1 observamos grande quantidade de transcrito em miracídio e também a presença de ortólogos a SmMKP1 em diversas espécies do gênero Schistosoma. As proteínas foram expressas em fusão a GST utilizando vetor de expressão pGEX. O teste de solubilidade mostrou que SmMAPK1, SmMKP1 e SmMKP2 estão presente na fase insolúvel, provavelmente em corpos de inclusão. Esse trabalho enfatiza a importância de se integrar projetos de sequenciamento do genoma, predição de proteínas, anotação manual dos genes e validação experimental para a identificação de proteínas alvo para o desenvolvimento de novas drogas